जीन अभियांत्रिकी की पुनर्योगज डी.एन.ए तकनीक के विभिन्न चरणों का उल्लेख कीजिए।

Explanation

जीन अभियांत्रिकी की सामान्य विधि (General Method of Genetic Engineering) पुनर्योगज DNA तकनीक जीन अभियांत्रिकी की प्रमुख विधि है इसके चरण निम्नलिखित हैं-
1. वांछित जीन की पहचान करना व पृथक्करण
2. वांछित जीन का क्लोनिंग वाहक में निवेशन
3. क्लोनिंग वाहक का चयन
4. क्लोन की गयी जीन की पहचान करना व अन्य जीवों में स्थानान्तरण
5. पुनर्योगज डी.एन.ए द्वारा परपोषी कोशिका में गुणन
6. वांछित जीन की अभिव्यक्ति
जीन अभियांत्रिकी की पुनयोंगज डी.एन.ए तकनीक के विभिन्न चरणों का
उल्लेख निम्नलिखित है-
1. वांछित जीन की पहचान व पृथक्करण (Identification and isolation of desired gene)
प्रतिबंध या सीमित अंत:न्यूक्लिएज (रेस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लिएज, Restriction endonuclease) एन्जाइम का प्रयोग वांछित जीन की पहचान कर उसे पृथक करने के लिए किया जाता हैं। वर्ष 1970 में हेमिल्टन ओ. स्मिथ (Hunillon O Smith) ने रेस्ट्रिक्शन एन्टोन्यूक्लिएज मजादा की बात की थी।
रेस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लिएज (Restriction Endonuclease)
1. ये एन्जाइम आण्विक कैचियों (Molecular scissors) की तरह होते हैं जो डी.एन.ए अणु को एक निश्चित स्थल (Specific site) पर काटते
2. ये एन्जाइम प्राकृतिक रूप से ई.कोलाई, बेसीलस, स्ट्रेप्टोकोकस, थर्मस एक्वेटिस आदि में पाए जाते हैं।
3. रिस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लिएज एन्जाइम तीन प्रकार के होते हैं।
टाइप I एन्डोन्यूक्लिएज (RI), टाइप II एन्डोन्यूक्लिएज (R-II), टाइप-III एन्डोन्यूक्लिएज (R-III)। टाइप-II एन्डोन्यूक्लिएज (R-II) का प्रयोग मुख्यत: जीन क्लोनिंग व रिस्ट्रिक्शन मानचित्रण में किया जाता है। उदाहरण Eco RI, Hind II आदि।
2. क्लोनिंग वाहकों का चयन (Selection of Cloning Vectors)
वांछित जीन को पृथक्कृत करने के बाद एक वाहक की आवश्यकता होती हैं जो वांछित जीन सहित परपोषी में प्रवेश करके अपने DNA की पुनरावृत्ति कर सके। एक वाहक में निम्नलिखित विशेषताएँ होनी चाहिए।
1. क्लोनिंग वाहक परपोषी कोशिका में पुनरावृत्ति के लिए स्वतन्त्र होना चाहिए।
2. क्लोनिंग वाहक परपोषी में आसानी से प्रवेश कर सके तथा पुनः पृथक्कृत हो सके।
3. रूपान्तरित कोशिकाओं के चयन में सहायता प्रदान करने के लिए क्लोनिंग वाहकों में एक चिन्हित स्थल (Markar site) होनी चाहिए।
4. वाहक अणु में ऐसे विशिष्ट प्रतिबन्ध स्थल होने चाहिए जिनको रिस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लिएज एन्जाइम आसानी से तोड़ सके। प्रतिबन्ध स्थल पर विजातीय डी.एन.ए. का निवेश आसानी से हो सकता है।
5. वाहकों के द्वारा रूपान्तरण सरल व दक्ष हो।
6. प्रमोटर (Promoter), ऑपरेटर (Operator) जैसे नियामक अवयव वांछित विजातीय डी.एन.ए. की अभिव्यक्ति के लिए वाहकों में उपस्थित होने चाहिए।
प्राकृतिक एवं मानव निर्मित दोनों प्रकार के वाहकों का प्रयोग ई. कोलाई में किया जा सकता है। इनमें प्रयुक्त होने वाले प्रमुख वाहक निम्नलिखित है
1. प्लाज्मिड (Plasmid)
2. जीवाणुभोजी (Bacteriophage)
3. वांछित जीन का क्लोनिंग वाहक में निवेशन (Insertion of ____desired gene in cloning vector)-वांछित जीन को वाहक जीन में जोड़ने के लिए दोनों जीनों में समान रेस्ट्रिक्शन स्थान बनाए जाते हैं। इसके बाद दोनों को जोड़ा जाता है। इसे लाइगेशन (Ligation) कहा जाता है। इस प्रक्रिया में निम्न एन्जाइमों की आवश्यकता होती है-
(i) रेस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लीएज (Restriction endonucleases)
(ii) मिथाइलेजेज (Methylases)
(iii) डी.एन.ए. लाइगेजेज (DNA Ligases)
(iv) एल्केलाइन फास्फेटेज (Alkaline phosphatases)
(v) रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (Reverse transcriptase)
(vi) निल टांसफरेजेज (Pauminal translanced)
4. पुनर्योगज DNA का परपोषी कोशिका में गुणन (Multiplication of recombinant DNA in host cell)-परपोषी कोशिका में DNA को पुनर्योगज दो प्रकार से निवेशित कराया जाता है-
1. रूपान्तरण द्वारा ((Transformation)
2. पारक्रमण द्वारा (Transduction)
इस प्रक्रिया में ई.कोलाई जीवाणु कोशिका का मुख्यत: प्रयोग परपोषी के रूप में किया जाता है। इन प्रक्रियाओं का अध्ययन पहले किया जा चुका है। ई. कोलाई कोशिका में पुनयोंगज DNA का गुणन होता है।
5. क्लोन की गई जीन की पहचान एवं अन्य जीवों में स्थानान्तरण (Identification of cloned gene and its transfer in other organisms) जब वांछित जीन को वाहक के साथ जोड़ा जाता है। तो कई अवांछित उत्पाद भी प्राप्त होते हैं। इन अवांछित उत्पाद को हटाने के लिए व परपोषी कोशिका में पुनर्योजी DNA का चयन करने के लिए विशेष प्रकार की जीन का प्रयोग किया जाता है। इस जीन को मार्कर जीन (Marker gene) कहा जाता है जो कि रूपान्तरित कोशिकाओं में विशेष लक्षण उत्पन्न करती है। इस जीन को वाहक डी.एन.ए. में जोड़ा जाता है। उदाहरण केनामाइसित प्रतिरोधक जीन
मार्कर जीन के अतिरिक्त कुछ जीन ऐसी भी हैं जो कोशिका में विशेष लक्षण प्ररूप प्रदर्शित करती है। ये रिपोर्टर जीन कहलाती हैं जो अपने लक्षण प्ररूप के कारण दूसरी कोशिकाओं से अलग दिखती हैं।
उदाहरण LUC (ल्यूसीफरेज) जीन जो जुगनू में उपस्थित होती है। तथा जैवप्रदीप्तीकरण (Bioluminiscence) उत्पन्न करती है।
6. वांछित जीन की अभिव्यक्ति (Expression of desired gene)-वांछित जीन से प्राप्त क्लोन जीन की अभिव्यक्ति का अर्थ है क्लोन जीन को ई.कोलाई से प्राप्त कर उसे किसी सूक्ष्मजीव, पादप या जन्तु में निवेशित करवाकर उससे वांछित उत्पाद प्राप्त करना। उदाहरण ई.कोलाई में इन्सुलिन उत्पादन|
वे पादप व जन्तु जिनमें विजातीय डी.एन.ए. उपस्थित होता है। ट्रान्सजैनिक पादप या ट्रॉन्सजैनिक जन्तु कहलाते हैं।